革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒大量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)
使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
操作步驟：
1、取50-200ml 細(xì)菌培養(yǎng)物，11000rpm離心5min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。
2、向留有菌體沉淀的離心管中加入5ml 溶液Ⅰ和1ml 溶菌酶，混勻。37℃水浴30 min 以上（根據(jù)菌液量可適當(dāng)加長(zhǎng)水浴時(shí)間，請(qǐng)先檢查溶液Ⅰ是否已加入 RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3、向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和以免污染基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。
4、向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm離心10 min ，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，11000rpm 離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完，可分兩次吸附) 。
6、向吸附柱中加入8ml 漂洗液( 使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇) ，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入6ml 漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、11000rpm離心5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去
除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR 等。
9、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加 1-2ml 經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min，收集質(zhì)粒DNA溶液。
10、（可選）為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，11000rpm離心2min。
注意事項(xiàng)：
1、使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于500ul，體積過(guò)小影響回收效率；洗脫液的pH 值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH值在8.0左右( 可用NaOH 將水的pH值調(diào)此范圍) ，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20 ℃，以防DNA降解。
3、如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用400-800ml培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。
4、DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰， OD260 值為1 相當(dāng)于大約50 μg/ml 雙鏈DNA、40 μg/ml 單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9 ，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。
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