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酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書
試劑盒采用酶法破碎酵母細(xì)胞壁和堿裂解法裂解酵母細(xì)胞來(lái)提取酵母質(zhì)粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細(xì)胞壁，提高酵母質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。本試劑盒無(wú)需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。
操作步驟：
使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。溶液YP1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1、取1-5ml酵母培養(yǎng)物（不超過(guò)5×107cells），12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。
2、酵母細(xì)胞壁的破除：
A、酶法：向酵母菌體中加入470ul山梨醇Buffer，充分懸浮菌體，加入25ul酵母破壁酶和5ul β-巰基乙醇，充分混勻，30℃處理1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm離心1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入250ul溶液YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌
塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入250ul溶液YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。加入150-200ul酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩10min。簡(jiǎn)短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請(qǐng)用溶液YP1補(bǔ)足250ul）于另一干凈離心管中。
3、向離心管中加入250ul溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。
4、向離心管中加入350ul溶液YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液YP3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。
9、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
10、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
注意事項(xiàng)：
1、使用前請(qǐng)先檢查溶液YP2和溶液YP3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul，體積過(guò)小影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
3、質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)?？截悢?shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)都很低，一般通過(guò)電泳或分光光度計(jì)法都很難檢測(cè)到，可通過(guò)PCR或轉(zhuǎn)化大腸桿菌來(lái)檢測(cè)。
4、DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的基因組DNA段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)?；厥盏玫降腄NA段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰， OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。
相關(guān)試劑：
R1020 酵母破壁酶溶液
D1900 酵母基因組DNA提取試劑盒
T1060 50×TAE 緩沖液
G8142 GoldView II型核酸染色劑(5000×)
E1020 EB染色液